染色凋亡试剂盒

　　细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。例如体内的癌细胞增长为肿瘤的过程会受细胞凋亡的引导而被抑制。然而在抑癌基因p53出现问题时，凋亡就不会诱导发生，从而导致癌细胞的不断增长。细胞凋亡可以通过细胞形态的变化或生物化学的变化来检测。目前常用的指标有caspase活性变化、DNA碎片、磷脂酰丝氨酸的外翻等。

　　染色凋亡试剂盒是一种采用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide ,PI )双荧光染色方法进行细胞周期与细胞坏死分析的检测试剂盒。单纯的PI染色能够观察DNA直方图上凋亡细胞的亚G1峰，但只能代表G0/G1期发生凋亡，无法观察S期和G2期发生的细胞凋亡，而且细胞经过固定后无法对活细胞和死细胞进行区分。Hoechst 33342可以穿透细胞膜，进入正常细胞和凋亡细胞与DNA结合，能在紫外线下显示蓝色荧光，而且染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。PI不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，PI可以穿透细胞膜使坏死细胞着色产生红色荧光。

　　检测与分析：用流式细胞仪在激发波长400～500nm检测蓝色荧光，在大于630nm 处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用荧光显微镜检测，检测前4℃ 1000g 离心3～5min沉淀细胞，用PBS洗涤一次，再涂片观察红色荧光和蓝色荧光。对于贴壁细胞使用荧光显微镜检测，亦可不收集细胞，弃培养液后直接依次按照上述比例加入试剂即可。

　　双染后，可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在二元直方图上，正常细胞对Hoechst 33342具有拒染性，呈弱蓝色荧光+弱红色荧光（Hoechst 33342+/PI+）；凋亡细胞对Hoechst 33342具有嗜染性呈强蓝色荧光+弱红色荧光（Hoechst 33342++/PI+）；坏死细胞对PI具有嗜染性，呈弱蓝色荧光+强红色荧光。本试剂盒亦可用荧光显微镜进行观察，检测细胞含量范围一般为0.1~1×106之间。

　　染色凋亡试剂盒试验注意事项：

　　1、荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。

　　2、在为了获得细胞沉淀的离心的过程中，对于特殊细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当提高离心力或延长离心时间。

　　3、Hoechst 33342与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20 min以内。太长容易引起Hoechst 33342的发射光谱由蓝光向红光迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变。