非洲绿猴肾细胞进行细胞传染的步骤

　　非洲绿猴肾细胞是从正常成年非洲绿猴的肾脏组织中分离建立的。该细胞常作为转染宿主，用于支原体的检测。细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超净台中操作；如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%的CO2的温箱中继续培养。细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代；弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞*脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。

　　非洲绿猴肾细胞Vero可能作为表达外源蛋白质的有用细胞。作为一种连续传代的灵长类细胞，Vero细胞的糖基化酶可能与人类的相似。Vero细胞可以大规模培养，已经用于脊髓灰质炎病毒疫苗的生产。研究了不同条件下Vero细胞的转染效率，包括脂质体和DNA的浓度，细胞数量以及细胞暴露于脂质体-DNA混合物中的时间。通过检测报告基因β-gal确定转染效率，优化不同转染参数，提高了Vero细胞脂质体转染的效率和表达水平。

　　非洲绿猴肾细胞进行细胞传染的步骤：

　　（1）在24孔细胞培养板中，以2.5~7.5×10°细胞/孔接种细胞于0.5ml适当*培养基中。

　　（2）37℃过夜培养细胞，直到细胞生长至50~80%汇和。

　　（3）在灭菌的Eppendorf管中准备下列溶液

　　溶液A：用25u1无血清培养基稀释0.25～0.5ug pCDNA3LacZ。

　　溶液B：用25ul无血清培养基稀释0.5~6.25ul lipofectAMINE试剂。

　　（4）温和混合两溶液，室温放置15~45分钟以利于DNA-脂质体复合物的形成，与此同时，用0.5ml无血清培养基冲洗细胞一次。

　　（5）混合物中加入0.2ml无血清培养基，温和混合，加入到漂洗过的细胞中。

　　（6）37℃二氧化碳温箱温育2~24小时。

　　（7）温育结束后，不清除转染混合物直接加入含两倍浓度血清的培养基。

　　（8）转染18~24小时后，换以新鲜的*培养基。

　　（9）48小时后，收获细胞或开始筛选。