--细 胞 基 本 信 息---

细胞名称： NK-92MI(人恶性非霍奇金淋巴瘤患者NK细胞)

细胞别称： NK-92MI MI; NK-92MI mi; NK92-MI; NK92MI; NK-92MI transfected with MFG-Hil2

细胞货号： SNL-195

生长特性： 悬浮

培养条件： 1640+10% FBS+1% P/S

培养环境： 空气，95%； 二氧化碳 (CO2)，5%；37℃

细胞简介： NK-92细胞是从一位患有急进性非霍奇金淋巴瘤的50岁白人男性外周血单核细胞衍生来的一株IL-2依赖型NK细胞株。NK-92MI细胞是转染得到的源自NK-92细胞的IL-2非依赖的NK细胞株，亲本细胞NK-92通过微粒体基因转化法用逆转录病毒MFG-hIL-2载体携带的人IL-2cDNA进行转化，可能由于载体整合到基因组DNA中，转化是稳定的。NK-92MI细胞细胞对很多恶性细胞有细胞毒性；铬释放试验显示它能杀死K562细胞和Daudi细胞。NK-92细胞有以下特征：CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、CD54表面标记阳性；CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD34和HLA-DR表面标记阴性。NK-92MI细胞和NK-92CI细胞这两个变种都包含、表达并合成hIL-2cDNA。NK-92MI细胞合成的IL-2水平比NK-92CI高，而亲本细胞不合成表达。1998年9月提交到ATCC的培养物污染了支原体，其后代通过BM细胞周期蛋白处理21天消除支原体，处理后6周，用Hoechst染色、PCR和标准培养测试进行支原体检测，结果都呈阴性。

细胞正常生长形态照片

NK-92MI细胞培养注意事项

l NK-92MI细胞呈聚团悬浮生长，细胞团较大时需要吹打成小团，防止团块中间的细胞因营养不足而死亡。除非实验需要，不建议经常将细胞吹散成单个细胞，否则细胞状态将变差；

l NK-92MI细胞对血清要求高，应该使用优质血清进行培养；

l NK-92MI细胞对吹打等机械刺激敏感，不要吹打太多次，注意控制吹打力度轻柔；

l NK-92MI细胞对温度敏感，培养基、PBS需复温至37℃再使用。

l NK-92MI细胞冻存难度较大，建议使用90% FBS+10%DMSO冻存液，冻存密度推荐300万细胞/毫升，不能过低。冻存时细胞应吹散成单细胞。

l 复苏时建议将血清浓度提高至20%，待细胞可以正常聚集生长后再将血清浓度恢复至10%

l NK-92MI细胞计数时算得的细胞的活率不能代表该细胞真实的状态。因为培养时存在一些散在的单细胞，这些细胞活性较低，且不能完*去除，导致在计数时细胞整体活率可能不高。细胞状态可以通过细胞能否聚团判断：只要大部分细胞能聚团生长，细胞状态就没有问题。当细胞状态不佳时，细胞无法顺利聚团。

l 当细胞状态不佳时，向培养基中按100-200U/mL补充IL-2，可有效改善。

NK-92MI细胞换液方法

l 半换液法：

1. 准备所需的培养基、离心管以及无菌枪头等；（培养基提前预热）

2. 将培养瓶竖立静置一段时间，待细胞沉底；（肉眼观察细胞沉底情况）

3. 吸头紧贴液面，小心吸出一半的培养基，转移到离心管；

4. 900-1000rpm 3min离心，离心管里若有细胞，则用新鲜培养基重悬后放回原瓶；

5. 原瓶补充一半的新鲜培养基。

Tips：建议半换液2-3次后进行离心换液。

l 离心换液法：

1. 准备所需的培养基、离心管以及无菌枪头等；（培养基提前预热）

2. 将所有细胞悬液转移至离心管中；

3. 900-1000rpm，3min离心；

4. 弃上清，加5mL PBS轻轻重悬细胞进行润洗，再900-1000rpm，3min离心；

Tips：此处PBS润洗是为了去除细胞碎片，平时培养若细胞碎片不多可以忽略此步骤。

5. 培养瓶中加入适量新鲜培养基；

6. 离心完成后弃上清，加适量新鲜培养基轻轻重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种回培养瓶中，混匀细胞，放入培养箱中继续培养。

NK-92MI细胞传代方法

l 离心法：

1. 准备所需的培养基、离心管以及无菌枪头等；（培养基提前预热）

2. 用移液器吸取培养瓶内细胞悬液转移至离心管中；

3. 900-1000rpm，3min离心收集细胞；

4. 在培养瓶中加入适量新鲜培养基；（T25推荐10mL，T75推荐20mL）

5. 离心完成后，弃离心管内上清，然后加入适量新鲜培养基，轻轻重悬吹散细胞，将细胞悬液均匀接种至培养瓶中，轻轻混匀后将细胞放入培养箱中继续培养。

l 直接分瓶法：

1. 轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分散；若有较大的细胞团，需吹散成小团。

2. 用移液器吸取培养瓶内细胞悬液，均分到若干个新培养瓶中，每瓶再补充适量的新鲜培养基，轻轻混匀后将细胞放入培养箱中继续培养。

Tips：

l 注意控制吹打力度尽可能轻柔和离心转速以及时间不要过高，避免细胞受机械损伤。

l 传代比例推荐1：2

NK-92MI细胞冻存方法

1. 准备所需的培养基、PBS、血清、DMSO、离心管以及无菌枪头等；（试剂需提前预热）

Tips：若冻存前培养基已经变黄，先换液静置培养4h左右，待细胞活力稳定后再进行冻存。

2. 根据收集到细胞量，配制相应量的冻存液，并准备相应数量的冻存管，在冻存管上标志细胞名称，代次，冻存时间等信息。推荐冻存液配方：90%FBS+10%DMSO；冻存密度300万细胞/mL/管。

Tips：冻存密度过低将导致复苏后状态不佳。

3. 将细胞悬液转移至离心管中1000rpm，3min离心收集细胞；

4. 离心完成后弃上清，加入相应量的配置好的冻存液轻轻重悬混匀细胞，将细胞悬液分装至冻存管中。注意吹打力度，不要产生过多气泡；

Tips：加入冻存液混匀细胞后及时分装并将细胞降温冻存，以减少DMSO对细胞的毒性。

5. 将细胞放置程序降温冻存盒中，再将冻存盒转移至-80℃冰箱进行降温冻存。

6. 次日（16h-24h后）复苏一管检查冻存效果，确认没问题后及时将冻存细胞放置液氮中保存，细胞在-80℃冰箱放置时间不要超过3天。

NK-92MI细胞复苏方法

1. 提前将水浴锅预热至37℃，培养基复温至室温或37℃，离心机设置好转速；

2. 将冻存细胞从液氮或-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，快速摇晃至完*融化，融化时间不超过2min；

Tips：

l 若液氮或冰箱距离细胞房较远，细胞需要放在干冰或冰盒上运送至细胞房。

l 水浴时使用一次性PE手套包住冻存管避免直接接触水源，避免污染。

3. 直接将冻存管900-1000rpm 2min离心，同时在培养瓶中加入适量新鲜培养基；

4. 离心完成后弃上清，吸取1mL新鲜培养基（建议血清浓度提高至20%）轻轻重悬细胞，吹散细胞后接种到培养瓶中；

5. 使用十字法或8字法将细胞混匀后置于培养箱中培养。

Tips：整个细胞复苏过程在尽可能5-10min内完成。

NK-92MI细胞收货攻略

1. 拆封包装盒，确认细胞，说明书等是否齐全，收货细胞名与所购买细胞是否符合；

2. 观察细胞培养瓶是否完好，有无漏液，培养瓶内培养基是否有肉眼可见的絮状物或者浑浊等，发现异常及时拍照联系销售人员；

3. 确认无异常后，将培养瓶表面消毒，然后撕掉封口膜竖立放入培养箱平衡4h左右，让悬浮细胞沉下培养瓶底部；

4. 平衡过程中可以仔细阅读细胞说明书，知悉细胞所需培养体系，培养环境以及培养注意事项等；

5. 平衡完成后竖立取出细胞培养瓶，此时大部分细胞沉在培养瓶底部，小心吸取上清至离心管中，保留10mL左右培养基在培养瓶内，小心操作，尽量不要吸到沉在底部的细胞；

6. 将离心管1200rpm，5min离心收集未沉下培养瓶底部的细胞，上清可以4℃保存，后续用于培养细胞，以平稳过度到自己的培养基。将收集到的细胞接种至原培养瓶；

7. 观察细胞，根据细胞状态，以及团块数量、大小决定传代或继续培养。

常见问题及解决方案

培养过程中细胞碎片较多怎么处理？

1. 细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变，大部分细胞都会有这种现象，只是不同细胞颗粒多少有区别，细胞培养体系不适应、营养缺乏、渗透压异常等均可能导致细胞内颗粒增加，建议使用合适的培养条件。

2. 细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞代谢产物，可通过900-1000rpm，3min离心以去除部分碎片。少量碎片不影响细胞生长，不建议频繁离心。

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