--细 胞 基 本 信 息---

细胞名称： NK-92(人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞)

细胞别称： NK92; Natural Killer-92; NK-92.05; Neukoplast; aNK

细胞货号： SNL-405

生长特性： 悬浮

培养条件： MEMα+20% FBS+0.2mM Inositol+0.1mM β-mercaptoethanol+0.02mM Folic Acid+100-200U/mL recombinant IL-2+1% P/S

培养环境： 空气，95%； 二氧化碳 (CO2)，5%；37℃

细胞简介： NK-92细胞是从一位患有急进性非霍奇金淋巴瘤的50岁白人男性外周血单核细胞衍生来的一株IL-2依赖型NK细胞株。NK-92细胞对很多恶性细胞有细胞毒性，铬释放试验显示它能杀死K562细胞和Daudi细胞。NK-92细胞(经过照射以防止增殖)可以有效地用于血液中白血病的体外免疫清扫而不危及血细胞的功能。NK-92细胞有以下特征：CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、CD54表面标记阳性；CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD34和HLA-DR表面标记阴性。NK-92细胞依赖于重组IL-2的存在，低至10U/mL的剂量足以维持增殖；在缺乏IL-2的情况下，细胞将在72小时内死亡。ATCC通过PCR证实该细胞系Epstein-Barr病毒DNA序列呈阳性。NK-92细胞可以用于3D细胞培养、免疫学研究、毒理研究，也是一种合适的转染宿主。

细胞正常生长形态照片

NK-92细胞培养注意事项

l NK-92细胞呈聚团悬浮生长，细胞团较大时需要吹打成小团，防止团块中间的细胞因营养不足而死亡。除非实验需要，不建议经常将细胞吹散成单个细胞，否则细胞状态将变差；

l NK-92细胞对培养基和血清要求高，培养基严格按照配方配制，并且应该使用优质血清进行培养；

l NK-92细胞对IL-2有依赖性，如果缺少IL-2细胞将很快死亡。需注意IL-2容易降解，若购买商品化完*培养基，要保存得当并在保质期内尽快用完；若自己配制培养基，IL-2可以采用现配现用的方法；

l 建议常备IL-2，当细胞状态不佳时，额外向培养基中按200U/mL补充IL-2，可有效改善。

l NK-92细胞对吹打等机械刺激敏感，不要吹打太多次，注意控制吹打力度轻柔；

l NK-92细胞对温度敏感，培养基、PBS需复温至37℃再使用。

l NK-92细胞冻存难度较大，建议使用90% FBS+10%DMSO冻存液，冻存密度推荐300万细胞/毫升，不能过低。冻存液中不必加IL-2。冻存时细胞应吹散成单细胞。

l NK-92细胞计数时算得的细胞的活率不能代表该细胞真实的状态。因为培养时存在一些散在的单细胞，这些细胞活性较低，且不能完*去除，导致在计数时细胞整体活率可能不高。细胞状态可以通过细胞能否聚团判断：只要大部分细胞能聚团生长，细胞状态就没有问题。当细胞状态不佳时，细胞无法顺利聚团。

NK-92细胞换液方法

l 半换液法：

1. 准备所需的培养基、离心管以及无菌枪头等；（培养基提前预热）

2. 将培养瓶竖立静置一段时间，待细胞沉底；（肉眼观察细胞沉底情况）

3. 吸头紧贴液面，小心吸出一半的培养基，转移到离心管；

4. 900-1000rpm 3min离心，离心管里若有细胞，则用新鲜培养基重悬后放回原瓶；

5. 原瓶补充一半的新鲜培养基。

Tips：建议半换液2-3次后进行离心换液。

l 离心换液法：

1. 准备所需的培养基、离心管以及无菌枪头等；（培养基提前预热）

2. 将所有细胞悬液转移至离心管中；

3. 900-1000rpm，3min离心；

4. 弃上清，加5mL PBS轻轻重悬细胞进行润洗，再900-1000rpm，3min离心；

Tips：此处PBS润洗是为了去除细胞碎片，平时培养若细胞碎片不多可以忽略此步骤。

5. 培养瓶中加入适量新鲜培养基；

6. 离心完成后弃上清，加适量新鲜培养基轻轻重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种回培养瓶中，混匀细胞，放入培养箱中继续培养。

NK-92细胞传代方法

l 离心法：

1. 准备所需的培养基、离心管以及无菌枪头等；（培养基提前预热）

2. 用移液器吸取培养瓶内细胞悬液转移至离心管中；

3. 900-1000rpm，3min离心收集细胞；

4. 在培养瓶中加入适量新鲜培养基；（T25推荐10mL，T75推荐20mL）

5. 离心完成后，弃离心管内上清，然后加入适量新鲜培养基，轻轻重悬吹散细胞，将细胞悬液均匀接种至培养瓶中，轻轻混匀后将细胞放入培养箱中继续培养。

l 直接分瓶法：

1. 轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分散；若有较大的细胞团，需吹散成小团。

2. 用移液器吸取培养瓶内细胞悬液，均分到若干个新培养瓶中，每瓶再补充适量的新鲜培养基，轻轻混匀后将细胞放入培养箱中继续培养。

Tips：

l 注意控制吹打力度尽可能轻柔和离心转速以及时间不要过高，避免细胞受机械损伤。

l 传代比例推荐1：2

NK-92细胞冻存方法

1. 准备所需的培养基、PBS、血清、DMSO、离心管以及无菌枪头等；（试剂需提前预热）

Tips：若冻存前培养基已经变黄，先换液静置培养4h左右，待细胞活力稳定后再进行冻存。

2. 根据收集到细胞量，配制相应量的冻存液，并准备相应数量的冻存管，在冻存管上标志细胞名称，代次，冻存时间等信息。推荐冻存液配方：90%FBS+10%DMSO；冻存密度300万细胞/mL/管。

Tips：冻存密度过低将导致复苏后状态不佳。

3. 将细胞悬液转移至离心管中1000rpm，3min离心收集细胞；

4. 离心完成后弃上清，加入相应量的配置好的冻存液轻轻重悬混匀细胞，将细胞悬液分装至冻存管中。注意吹打力度，不要产生过多气泡；

Tips：加入冻存液混匀细胞后及时分装并将细胞降温冻存，以减少DMSO对细胞的毒性。

5. 将细胞放置程序降温冻存盒中，再将冻存盒转移至-80℃冰箱进行降温冻存。

6. 次日（16h-24h后）复苏一管检查冻存效果，确认没问题后及时将冻存细胞放置液氮中保存，细胞在-80℃冰箱放置时间不要超过3天。

NK-92细胞复苏方法

1. 提前将水浴锅预热至37℃，培养基复温至室温或37℃，离心机设置好转速；

2. 将冻存细胞从液氮或-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，快速摇晃至完*融化，融化时间不超过2min；

Tips：

l 若液氮或冰箱距离细胞房较远，细胞需要放在干冰或冰盒上运送至细胞房。

l 水浴时使用一次性PE手套包住冻存管避免直接接触水源，避免污染。

3. 直接将冻存管900-1000rpm 2min离心，同时在培养瓶中加入适量新鲜培养基；

4. 离心完成后弃上清，吸取1mL新鲜培养基（建议血清浓度提高至20%）轻轻重悬细胞，吹散细胞后接种到培养瓶中；

5. 使用十字法或8字法将细胞混匀后置于培养箱中培养。

Tips：整个细胞复苏过程在尽可能5-10min内完成。

NK-92细胞收货攻略

1. 拆封包装盒，确认细胞，说明书等是否齐全，收货细胞名与所购买细胞是否符合；

2. 观察细胞培养瓶是否完好，有无漏液，培养瓶内培养基是否有肉眼可见的絮状物或者浑浊等，发现异常及时拍照联系销售人员；

3. 确认无异常后，将培养瓶表面消毒，然后撕掉封口膜竖立放入培养箱平衡4h左右，让悬浮细胞沉下培养瓶底部；

4. 平衡过程中可以仔细阅读细胞说明书，知悉细胞所需培养体系，培养环境以及培养注意事项等；

5. 平衡完成后竖立取出细胞培养瓶，此时大部分细胞沉在培养瓶底部，小心吸取上清至离心管中，保留10mL左右培养基在培养瓶内，小心操作，尽量不要吸到沉在底部的细胞；

6. 将离心管1200rpm，5min离心收集未沉下培养瓶底部的细胞，上清可以4℃保存，后续用于培养细胞，以平稳过度到自己的培养基。将收集到的细胞接种至原培养瓶；

7. 观察细胞，根据细胞状态，以及团块数量、大小决定传代或继续培养。

常见问题及解决方案

培养过程中细胞碎片较多怎么处理？

1. 细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变，大部分细胞都会有这种现象，只是不同细胞颗粒多少有区别，细胞培养体系不适应、营养缺乏、渗透压异常等均可能导致细胞内颗粒增加，建议使用合适的培养条件。

2. 细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞代谢产物，可通过900-1000rpm，3min离心以去除部分碎片。少量碎片不影响细胞生长，不建议频繁离心。

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