细胞攻略 |Hi-five(昆虫细胞)细胞培养教程

细胞基本信息

 细胞正常生长形态

细胞名称：Hi-five(昆虫细胞)

细胞别称： BTI-Tn-5B1-4；BTI-TN-5B1-4; BTI-TN5B1-4; BTI-Tn5B14; BTI-Tn 5B1-4; Tn-5B1-4; Tn 5B1-4; Tn5 B1-4; Tn5B1-4; TN5B14; TnH5; High Five; High 5; High-5; High5; Hi-5; Hi5; Tn-5

细胞货号： SNL-191

生长特性： 半贴壁

培养条件： Grace's Insect Medium（Supplemented）+10%FBS+1% P/S

培养环境：空气，100%；

细胞简介： Hi-five(BTI-TN-5B1-4)细胞是由武汉大学生命科学学院胡远扬教授提交保藏。Hi-five(BTI-TN-5B1-4)细胞是一株昆虫细胞，主要用于昆虫病毒的扩增、病毒与宿主细胞相互作用的研究等。

Hi-five(昆虫细胞)特点

1、细胞静置培养时半贴壁生长，也可以使用摇瓶悬浮培养

静置培养时细胞会大量附着瓶底生长，呈半贴壁状态，会有少部分细胞悬浮生长；

摇瓶培养时可以很快适应悬浮生长，呈单个或小聚团悬浮生长；

2、对温度极为敏感

细胞于26-28℃空气培养，需要尽量控制温度，保证细胞生长状态；

若温度低于26℃，细胞生长速度会变慢，但恢复温度后生长速度会逐渐恢复，不会对细胞产生过大伤害；

若温度28℃-30℃，细胞生长严重受限；若温度高于30℃，细胞将受不可逆伤害导致无法使用，即使温度恢复也无法恢复正常生长状态；

同时注意使用的培养基、PBS及其他试剂应复温至室温（最好26-28℃），尽量减少观察细胞次数和时间；

3、细胞对吹打、气泡等机械损伤敏感

细胞操作时若吹打力度过大、气泡过多将严重影响细胞生长状态，导致细胞后续存活率降低，注意操作轻柔；

4、细胞可以适应多种培养体系

该细胞多用于真核细胞蛋白表达系统，因此针对该细胞有诸多培养体系，例如Grace's Insect Medium、SF900 II、TNM-FH、ESF921等培养体系，包括含血清的培养体系和不含血清的培养体系，可以根据自身实验需要选择逐步更换为合适的培养体系；

5、细胞对吹打、气泡等机械损伤敏感

细胞操作时若吹打力度过大、气泡过多将严重影响细胞生长状态，导致细胞后续存活率降低，注意操作轻柔；

 6、细胞冻存存活率不高

实际实验过程中，尚恩发现Hi-five细胞疑似表现出较低的冻存保存能力，冻存后活率会随保存时间增加而逐渐下降，因此若有持续培养该细胞或者需要快速复苏进行实验需求的实验室建议定期复苏培养细胞并重新冻存以保证细胞冻存活性不会下降至无法接受的范围；

7、细胞贴壁培养后可能会伸出触角

细胞在贴壁培养时，一周左右会有部分细胞伸出较长触角，同一个培养瓶培养时间越长，有触角的细胞可能越多，这是细胞自然现象，非细胞交叉污染或状态不佳；

细胞收货攻略

常温细胞

1.T25瓶收货后，拆开外包装，用75%酒精消毒T25瓶表面，放28℃培养箱静置2-4h；

2.吸走大部分培养基并留10-12 ml，显微镜下拍照保存细胞状态照片，观察细胞密度，若细胞密度大于80%即可按比例传代（传代比例建议1：2），若细胞密度低于70%可以留10-12 ml继续培养至细胞密度80%以上再进行传代培养；

冻存细胞

1.细胞收货后尽快开箱检查，若干冰充足可以取出细胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天内复苏）短期保存或液氮中长期保存，若干冰挥发建议立即复苏细胞并联系销售人员解决；

2.冻存细胞建议尽快复苏一管培养检查，以免超出售后期，复苏步骤参考复苏攻略；

3.复苏一管细胞出现异常及时联系销售人员，在专业技术支持的指导下进行下一步操作；

Tips

1.细胞收货出现漏液、培养瓶破损、干冰挥发等异常情况时，及时拍照联系销售人员；

2.该细胞贴壁生长，一般T25瓶运输过程中较少出现大量细胞脱落并聚团的情况，少量细胞脱落是正常状态，不影响细胞生长，按正常操作步骤继续培养即可。

3.尚恩生物T25瓶发货的细胞内含对应细胞的培养基，可以收集原装培养瓶内培养基经1500rpm离心5min后，取上清于4℃保存用于后续细胞培养；

细胞传代攻略

1.轻轻拍打培养瓶背面，使细胞松动，吸取瓶内培养基轻轻吹打细胞面使细胞脱落，少量未脱落的细胞可以留着继续培养；

2.收集细胞悬液，混匀细胞，900rpm离心3-5min，弃上清；

3.加3-5ml PBS重悬细胞，再次混匀细胞，900rpm离心3-5min，弃上清；

4.加新的培养基轻轻重悬细胞，均匀分到新的培养瓶里，补足培养基，将培养瓶放回培养箱静置培养；

Tips

1. 注意操作轻柔，尽量降低吹打力度、避免产生气泡；

2. T25瓶加10-12ml培养基，10cm皿加12-15ml，30%密度4-5天换液一次，30-50%密度3-4天换液一次，50-80%密度2-3天换液一次，80%以上每天换液；

3. 细胞收货后传代建议按1：2传代，后续培养可以视具体细胞生长状态和密度情况决定传代比例；

4. 传代后24h建议观察细胞并换液一次去除死亡细胞；

细胞冻存攻略

冻存步骤

1.先将细胞按传代步骤收集离心，至传代步骤3，弃细胞上清，获得细胞沉淀；

2.加入适量预先配好的程序性冻存液轻轻重悬细胞，并将细胞悬液转移至做好标记的冻存管中；

3.将冻存管放入程序性冻存盒，放入-80℃冰箱过夜；

4.转移细胞至液氮保存并登记细胞保存位置，液氮保存24h后建议复苏一管检测冻存细胞的活性，若活性合格即可长期保存，若低于80%建议重新冻存；

Tips

1.检测冻存细胞活性结果未合格前，培养瓶内细胞建议继续培养直至确认冻存合格方可视需要丢弃；

2.程序性冻存液需要配合程序性冻存盒使用，若使用非程序冻存液可以按产品说明书处理降温过程；

3.T25培养瓶长满通常可以冻存2-3管，10cm皿长满可以冻存3-4管；

细胞复苏攻略

复苏步骤

1.将所需的培养基放在培养箱预热30min后开始复苏；

2.准备37度温水，将细胞从液氮罐取中出，观察管内无液氮的情况下，捏住管盖，将细胞冻存部分浸入温水轻轻摇晃，融化至米粒大小冰块，终止水浴；

3.将冻存管以离心力150g(约900rpm)左右离心1-2min，不同离心机具体转速会有差异；

4.离心完成后弃冻存液，用刚才预热的培养基缓慢加入冻存管，并轻柔重悬细胞后接种至T25或者10cm皿中，轻轻混匀后放入培养箱；

5.24h后观察细胞并换液一次，放回培养箱继续培养；

Tips

1.冻存管在液氮长期保存过程中难免渗入液氮，取出细胞时震动不要过大，水浴前一定要观察管内是否存在液氮，若有液氮建议静置一会待液氮蒸发后再水浴；

2.水浴时可以使用一次性PE手套包住冻存管避免直接接触水源，可以降低管盖缝隙渗入水导致污染的概率；

3.水浴至剩米粒大小时及时终止水浴，避免过度水浴或水浴时间不足；

4.建议水浴完成后直接在离心管内离心细胞，避免再次转移细胞；

5.复苏后的细胞比较脆弱，吹打和转移细胞时尽量轻柔，复苏24h后换液去除死亡细胞；

常见问题及解决方案

1、细胞密度怎么计算的？

严格意义上，细胞密度需要收集细胞悬液计数细胞数量，但在实际培养过程中，并不需要为了精确控制细胞数量而消化细胞计数。因此，常用的细胞密度指细胞相对于最大生长密度的比值，贴壁细胞可以粗略的用细胞所占培养容器底面积百分比表示，即显微镜下观察培养容器底部，有细胞的区域占总区域的百分比值，当然这种表达方式受限于单个细胞生长不同密度时所占面积不同导致并不严谨，但也是相当直观、简便的表现细胞状态的一种方式；

NO.2培养过程中细胞碎片较多怎么处理？

1. 细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变，大部分细胞都会有这种现象，只是不同细胞颗粒多少有区别，细胞培养体系不适应、营养缺乏、渗透压异常等均可能导致细胞内颗粒增加，建议使用合适的培养条件。

2. 细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞代谢产物，可以先吸走培养基后用PBS润洗清除，再加新的培养基继续培养。润洗不能清除的可以换液清洗后等细胞密度70-80%左右消化处理细胞，消化完成后加培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液900-1000rpm(约150g)离心3min，弃上清。再加5ml PBS重悬细胞，再离心后，用培养基重悬接种到新的培养皿。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS多洗几次。

NO.3悬浮培养需要怎么操作？

本公司Hi-five细胞自适应悬浮培养，基本无需训化。 需要悬浮培养前需保证细胞活性90%以上，收集细胞悬液，以1x10⁷细胞/ml的密度接种至摇瓶中培养即可。摇瓶培养转速跟实际条件相关，尚恩使用转速约100rpm/min，客户可以根据自身实验室情况选择合适的转速（通常80-150rpm之间）。

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