大鼠滑膜细胞的制备方法

　　大鼠滑膜细胞的制备方法：
 

　　滑膜细胞的培养：将分离的滑膜组织用含青霉素200kU/L、链霉素200mg/L的D-Hank's液漂洗3次以减少污染机会；去掉脂肪组织，将16个滑膜组织样本平均分为A、B两份。将A份不加处理分为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8八个样品，将B份用手术剪剪碎后分为B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8八个样品。分别采取4种不同方法进行处理。
 

　　1)不加消化酶消化法：分别将A1、A2、B1、B2离心洗涤2次(2500r/min，离心6min)，吸弃上清液，加入100μL100%的FBS混匀，用移液枪吸出注入培养瓶中，放入CO2培养箱烘干15min，再将A1、B1加入3mL体积分数20%的FBS吹打均匀，A2、B2用少量体积分数20%的FBS人工贴壁，再加入3mL体积分数20%的FBS。
 

　　2)加Ⅱ型胶原酶消化法：将A3、A4、B3、B4离心洗涤2次(2500r/min，离心6min)，吸弃上清液，吸取胶原酶Ⅱ至离心管中，轻轻吹打使组织块重新悬浮，移入培养瓶，放入CO2培养箱消化，观察组织成絮状后，加入1mL体积分数20%FBS终止消化，用移液枪吸出，移入离心管离心(2500r/min，离心6min)，弃上清液，放入培养瓶中，A3、B3加入3mL体积分数20%FBS，吹打均匀；A4、B4用少量体积分数20%的FBS人工贴壁，再加入3mL体积分数20%的FBS。
 

　　3)加胰蛋白酶消化法：将A5、A6、B5、B6离心洗涤2次(2500r/min，离心6min)，吸弃上清液，吸取胰蛋白酶至离心管中，轻轻吹打使组织块重新悬浮，移入培养瓶，放入CO2培养箱消化，观察组织成絮状后，加入体积分数20%FBS终止消化，用移液枪吸出，移入离心管离心(2500r/min，离心6min)。弃上清液，放入培养瓶中，A5、B5加入3mL体积分数20%FBS，吹打均匀；A6、B6用少量体积分数20%的FBS人工贴壁，再加入3mL体积分数20%的FBS。
 

　　4)先加Ⅱ型胶原酶消化法再加胰蛋白酶消化：将A7、A8、B7、B8离心洗涤2次(2500r/min，离心6min)，吸弃上清液，吸取胶原酶Ⅱ至离心管中，轻轻吹打使组织块重新悬浮，移入培养瓶，放入CO2培养箱消化，观察组织成絮状后，取出培养瓶，仔细吹打使组织块分散，将未黏附细胞移入离心管离心(2500r/min，离心6min)，弃上清液，再加D-Hank's液洗涤，离心，吸弃洗涤液，重复离心3次，吸取胰蛋白酶至离心管中，轻轻吹打使组织块重新悬浮，移入培养瓶，放入CO2培养箱消化，消化结束取出培养瓶，加入体积分数20%FBS终止消化，用移液枪吸出，移入离心管离心(2500r/min，离心6min)。弃上清液，放入培养瓶中，A7、B7加入3mL体积分数20%FBS，吹打均匀；A8、B8用少量体积分数20%的FBS人工贴壁，再加入3mL体积分数20%的FBS。
 

　　5)结果：培养9d后，观察各培养瓶中细胞的成活个数和生长状况，组织剪碎不加消化酶人工贴壁培养的细胞得数为2.03×106，是所有培养方法中细胞的数最多的。细胞活力为95%，与组织剪碎加胶原酶Ⅱ消化后人工贴壁培养同为各种培养方法中细胞活力*强的，综合考虑*方法为组织剪碎不加消化酶人工贴壁培养。